项目名称：    鱼类生长的内分泌学及其调控机制研究

推荐单位：    农业部

项目简介：    本项目属水产生物学领域。20年来，本项目对鱼类生长激素（GH）分离纯化、免疫测定技术、基因克隆、分泌调节机理及重组表达等进行了深入系统的研究，不仅建立了我国鱼类GH和生长内分泌学的研究体系，而且形成了我国鱼类生长内分泌学科，取得的主要发现和创新性成果包括：（1）分离纯化草鱼等多种鱼类GH并制备其抗体；创建了鲤科、鮨科和鲷科等6种鱼类GH酶标/放射免疫测定技术；（2）发现鱼类垂体GH的分泌属阵发式分泌型，分泌活动有明显季节性和日周期变化规律；阐明GH分泌活动与鱼体生长速率之间的关系；（3）发现鱼类GH分泌活动受多种神经内分泌因子的调控，其中促性腺激素释放激素（GnRH）、促甲状腺素释放激素（TRH）、多巴胺及其激动剂等都能刺激GH分泌，而生长抑素（SRIF）则抑制GH分泌；（4）发现IGF对GH基因表达的负反馈调控是通过激活垂体中钙调素基因的表达而进行的；（5）发现PACAP通过PAC-I型受体刺激垂体GH释放和基因表达的机制；（6）发现去甲肾上腺素通过激活a2肾上腺素受体抑制GH分泌的信号通路；（7）发现鱼类GH自分泌和旁分泌的反馈调节通路，建立了鱼类GH自分泌和旁分泌反馈調节的模型；（8）发现刺激GH分泌的神经内分泌因子等通过口服途径能显著促进GH分泌和提高鱼体生长速率，且这些因子共同使用，其促生长效果更为显著；（9）构建了斜带石斑鱼等多种鱼类cDNA文库，克隆了GH、IGF和PACAP等生长相关功能基因10多个，研制了基因重组GH；采用投喂方法证明它能为鱼消化道吸收而促进鱼体生长；（10）本项目发表论文148篇，其中SCI论文51篇，SCI引用597次，其中SCI他引443次；（11）本项目申请发明专利7项，其中1项获得授权；（12）这些成果不仅使我国鱼类生长内分泌学研究达国际领先水平，极大促进了我国鱼类内分泌学科的发展，而且对于世界鱼类内分泌学科的发展也作出了重要贡献，同时，这些成果对于促进水产养殖业的科技进步具有重要科学意义和应用价值。

主要发现点：  （1）发现垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)神经纤维进入鱼类生长激素(GH)细胞内的解剖学证据，阐明PACAP通过PAC-I型受体刺激垂体GH释放和基因表达的机制，首次提出了介导PACAP刺激GH分泌的信号转导机制的模型，克隆了鱼类第一个PACAP受体基因（代表性论文1、7和14; 所属学科：水生生物生理学）；（2）发现促性腺激素释放激素（GnRH）、促甲状腺素释放激素（TRH）、多巴胺激动剂（APO、SKF等）、PACAP、性类固醇激素（如雌二醇）等都能显著刺激各种鱼类脑垂体释放GH（代表性论文2、4和5）；（3）发现多巴胺（Dopamine）通过激活D1型-受体刺激鱼类垂体细胞释放GH，而这种刺激作用受生长抑素和性类固醇激素的负调节；发现多巴胺是鱼类性腺退化期GH释放的主要刺激因子，而GnRH则是性腺成熟期主要的GH释放因子；首次揭示了多巴胺刺激鱼类GH分泌的信号通路（代表论文3，9）；阐明了鱼类GH分泌的多因子调控机制（代表论文9; 所属学科：水生生物生理学）；（4）首次发现鱼类GH分泌为阵发式分泌，揭示草鱼血清GH水平存在明显的季节性和日周期性变化规律（代表性论文6; 所属学科：水产生物学）；（5）发现胰岛素样生长因子（IGF）对GH基因表达的负反馈调控是通过激活钙调素基因的表达而进行的（论文16）；（6）发现去甲肾上腺素通过激活a2肾上腺素受体抑制GH分泌的信号通路，这种抑制作用是通过抑制cAMP的生产以及其它的下游信号通路进行的，主要包括通过激活cAMP-, Ca2+-和 PKC-依赖的信号通路阻止GH分泌刺激信号的输入（论文35; 学科：水生生物生理学）；（7）发现鱼类GH和LH通过自分泌和旁分泌相互作用调节GH释放和GH基因表达的一个新的垂体内反馈通路，建立了鱼类GH自分泌和旁分泌反馈調节的模型；发现GH在垂体水平通过与JAK2/MAPK and JAK2/PI3K 信号通路偶联的GH受体发挥作用，上调GH分泌和GH基因表达；GH对其分泌和合成的正向自我调节作用代表鱼类生长调节的新机制（论文11、24和25; 所属学科：水生生物生理学）；（8）发现刺激GH分泌的神经内分泌因子如GnRH类似物、多巴胺激动剂、生长抑素抑制剂等通过口服途径能显著促进鱼类GH分泌和提高鱼体生长速率，且这些因子共同使用，其促生长效果最为显著（代表性论文8和43；所属学科：水产生物学）；（9）发现半胱胺（CSH）在鱼类起着生长抑素抑制剂的作用，能显著刺激草鱼、石斑鱼脑垂体释放GH和提高生长速率（论文26和29；所属学科：水产生物学）；（10）构建了斜带石斑鱼等多种鱼类cDNA文库，克隆了GH、IGF和PACAP等生长相关功能基因20多个，研制了基因重组GH；采用投喂方法证明它能为鱼消化道吸收而促进鱼体生长（代表性论文10、27、32）；（11）创建了鲤科鱼类GH单克隆抗体杂交瘤细胞系和酶联免疫测定技术、鮨科和鲷科鱼类生长激素放射免疫测定技术、鲤科和鲷科鱼类生长激素酶标受体或放射受体分析法以及鱼类脑垂体碎片离体孵育灌流系统等一系列技术方法（论文40、41）（所属学科：水产生物学）。

主要完成人：  1.   林浩然

为项目负责人，对发现点2、3、5、8、9、10和11作出创造性贡献，在该项目中的工作量占本人工作量的70%以上。 建立了鱼类GH放射免疫测定技术和垂体离体孵育灌流系统; 首次证明鱼类生长激素分泌特点和哺乳类相似，亦是阵发式分泌型; 发现促性腺激素释放激素LHRH-A和sGnRH-A不仅刺激鱼类GTH分泌的活性最强，而且刺激GH分泌的活性亦最强；证明TRH，多巴胺激动剂（如APO，SKF等），性类固醇激素和生长抑素抑制剂（CSH）等都能显著刺激鲤鱼脑垂体分泌GH和鱼体生长; 采用投喂方法证明鱼类消化道能吸收外源多肽激素和药物并保持其生物活性; 采用基因工程技术研究GH，IGF，PACAP等基因的结构和功能，获得基因重组产物，为基因重组产品开发利用打下基础。

2.   陈松林

为该项目中部分课题的负责人。对发现点4、8、9、10和11作出创造性贡献，在该项目中的工作量占本人工作量的60%以上。为国内最早开展鱼类生长激素（GH）和生长内分泌研究的学者之一，建立了从同一批鱼垂体中分离纯化GH、催乳激素和促甲状腺素的技术方法；分离纯化出草鱼GH，建立了分泌抗草鱼GH单克隆抗体的杂交瘤细胞系，建立了既能测定GH生物活性、又能测定其免疫活性的酶标受体测定方法；建立了鲤科鱼类GH夹心式酶标免疫测定技术（ELISA）；发现草鱼种体内GH分泌存在季节性和日变化规律；阐明了外源GH在鱼体内的代谢规律； 最早提出将半胱胺（CSH）作为鱼类生长抑素抑制剂的研究思路；克隆了鲢生长激素基因，并在大肠杆菌中进行了表达。

3.   李文笙

对发现点1、2、8、10和11作出创造性贡献，在项目中的工作量占本人工作量的60%以上。负责建立液相杂交/RNase 保护法检测鲤鱼GH基础mRNA水平的年周期变化；负责完成促性腺激素释放激素及其类似物、生长激素释放因子和抑制因子对鲤鱼脑垂体GH分泌和GH mRNA 水平影响的研究；负责完成甲状腺激素和促甲状腺素释放激素对鲤鱼GH分泌和GH mRNA水平影响的研究；负责完成性类固醇激素对鲤鱼GH分泌和基因表达调控作用的研究；负责完成石斑鱼GH基因的克隆和表达研究；参加并指导完成石斑鱼GH放射免疫测定方法和ELISA方法的建立；完成石斑鱼胰岛素样生长因子（IGF）Ⅰ和Ⅱ基因，脑垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）基因等的克隆、时空表达分析等工作。

4.   黄安林

对发现点1、3、5、6、7作出创造性贡献，在该项目中的工作量超过本人工作量的60%。首次阐明GnRH和DA D1－刺激的GH释放的信号转导机制; 发现PACAP神经纤维进入GH细胞内的解剖学证据，阐明PACAP通过PAC-I型受体刺激垂体GH释放和基因表达的机制，提出了介导PACAP刺激GH分泌的信号转导机制的模型; 用草鱼作为模型，发现在GH和LH之间通过自分泌和旁分泌相互作用调节GH释放和GH基因表达的一个新的垂体内反馈通路; 首次发现GH在垂体水平通过与JAK2/MAPK and JAK2/PI3K 信号通路偶联的GH受体上发挥作用，上调GH分泌和GH基因表达; 首次发现促性腺激素细胞分泌的LH能够以旁分泌的形式促进GH分泌细胞中GH转录子的翻译和GH基因的转录。

5.   张为民

对发现点4、10和11作出创造性贡献，在该项目中的工作量占本人工作量的40%以上。 参加实验并证明鱼类生长激素分泌活动的特点是阵发式分泌; 系统观察与测定草鱼血清生长激素，含量的昼夜变化; 参加实验并证明草鱼在饥饿一段时间后再投喂，出现明显的补偿生长; 参加草鱼基因重组生长激素的分离纯化实验，为生产草鱼基因生长激素提出有效的技术路线; 参加斜带石斑鱼生长激素cDNA克隆并在大肠杆菌进行融合表达; 参加黑鲷生长激素受体基因克隆及表达调节。

10篇代表性论文：  1.   Hypophysiotropic action of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the goldfish: Immunohistochemical demonstration of PACAP in the pituitary, PACAP stimulation of growth hormone

2.   Growth hormone and gonadotropin secretion in the common carp (Cyprinus carpio): In vitro interactions of gonadotropin-releasing hormone, somatostatin, and the dopamine agonist apomorphine. General and

3.   Dopamine stimulates growth hormone release from the pituitary of goldfish, Carassius auratus, through the dopamine D1 receptors. Endocrinology 130: 1201-1210

4.   The regulatory effects of thyrotropin-releasing hormone (TRH) on growth hormone secretion from perfused pituitary of common carp in vitro. Fish Physiology and Biochemistry, 11: 71-76.

5.   Effects of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) analogs and sex steriods on growth hormone (GH) secretion in common carp (Cyprinus carpio) and grass carp (Ctenopharyngodon idellus). Aquaculture, 135:

6.   Espodic growth hormone secretion in the grass carp, Ctenopharyngodon idellus. General and Comparative Endocrinology, 95: 337-341.

7.   Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide as a novel hypophysiotropic factor in fish. Biochem. Cell. Biol. 78:329-343

8.   Effects of gonadotropin-releasing hormone on growth hormone secretion and gene expression in common carp pituitary. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B. 132: 335~341.

9.   Interactions of somatostatin, gonadotropin- releasing hormone, and the gonads on dopamine-stimulated growth hormone release in the goldfish. Gen Comp Endocrinol 92:366-378

10.  Development and validation of a Noncompetitive enzyme-linked immunosorbent assay for the growth hormone of grass carp (Ctenopharyngodon idellus). Acta Zoologica Sinica 42,(2):386-393.