项目名称：    对虾白斑综合症病毒（WSSV）基因组和蛋白质组研究

推荐单位：    国家海洋局

项目简介：    对虾白斑综合症病毒WSSV最早出现在上世纪90年代初，是一种具有高度感染性和致死性的病毒，严重危害全球对虾养殖业并造成巨大的经济损失，仅我国自1993年爆发以来已累计损失数百亿元，成为海水养殖业危害最大的病毒。WSSV的肆虐立刻引起了许多国家和地区（中国、美国、日本、台湾地区、荷兰、印度、韩国、新加坡等）的高度重视，但由于缺乏对病毒遗传信息和功能特性的了解，影响了病毒的防治研究。

本项目组针对国内外在WSSV研究方面的难点，自1995年起开展了该病毒基因组分离和纯化，克服了在提取过程中病毒基因组被降解和宿主DNA污染的问题，获得了高纯度完整的病毒基因组DNA，经电泳分析首次发现该病毒的基因组超过290kb，是一种尚未被人们所揭示的大病毒。在突破了该技术难点后，项目组开展了病毒结构基因组研究，率先在国际上破译了WSSV全基因组序列，其大小为305kb，是目前发现的最大病毒之一，预测编码基因约180个，与以往发现的病毒无任何同源性。该成果被科技部评为1999年中国基础科学研究十大新闻，并于2000年被两院院士评为中国十大科技进展新闻。上述发现不仅对WSSV的分子遗传背景有了全面的了解，而且促使国际病毒分类委员会（ICTV）对WSSV分类地位的重新确认，将其单独归在新命名的病毒科Nimaviridae和病毒属Whispovirus。

随后项目组开展了WSSV功能基因和蛋白质组的研究，首次利用蛋白质质谱技术鉴定了约20多个病毒结构蛋白，并利用蛋白印迹和金标免疫电镜术确证了其中8个病毒膜蛋白。随后通过电泳分离结合质谱鉴定发现实际上病毒粒子由20多种膜蛋白和8种核衣壳蛋白组成，使我们对该病毒粒子的基本结构有了较为深刻的认识，有助于进一步揭示病毒粒子的感染和包装过程，以及与宿主的相互作用，为建立特异性阻断病毒感染的方式提供了科学依据和技术支撑。

本项目共发表国际SCI论文17 篇，其中影响因子超过3的10 篇。他引（正面引用）总次数191篇，其中单篇他引次数超过8的有8篇。

主要发现点：  1. 首次建立对虾白斑综合症病毒（WSSV）基因组纯化技术，该方法摈弃了常规纯化病毒所采用的密度梯度超速离心，不仅大大缩减了纯化步骤和时间，提高了病毒得率，而且在提取过程利用蛋白质抑制剂预防虾组织蛋白酶对病毒粒子的损害，再加上DNase处理除去宿主基因组污染，使最后获得的病毒基因组DNA纯度非常高，保证了高质量病毒基因组文库的构建。另外我们还发展了一种从感染WSSV的螯虾组织中快速制备病毒的方法，能获得大量高纯度有感染活性的病毒粒子，有利于病毒膜蛋白的功能研究和病毒感染机理研究。所属学科分类：水产保护学；代表性论文-1和8

2. 在国际上率先完成WSSV全基因组序列测定，基因组大小为305kb，是目前最大的病毒之一（目前发现基因组超过300kb的病毒总计7个，见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/vis.html），约有180个编码基因，有9个可能的复制起始区。同源性检索显示，除了几个与核酸代谢相关的基因有一定的同源性外，95%以上的基因或其编码蛋白与已知的病毒基因或蛋白没有任何同源性，另外还发现一个以往从未在病毒基因组中存在的胶原蛋白基因，说明WSSV是一个全新的病毒。 所属学科分类：水产保护学；代表性论文-2和6

3. 在国际上最先开展WSSV的蛋白质组学分析，首次鉴定了20多个病毒结构蛋白，并利用免疫电镜进行了病毒膜蛋白的定位验证研究，并且纠正了病毒结构蛋白VP26最初被认为是核衣壳蛋白的错误观点，同时发现该蛋白能与宿主细胞的骨架蛋白Actin有相互作用，暗示VP26在病毒粒子入核过程中起重要作用。另外抗体中和试验发现多种病毒膜蛋白的抗体具有中和病毒感染的作用，表明这些膜蛋白可能与WSSV的感染直接相关，对进一步开展抗病毒研究有重要意义。 所属学科分类：水产保护学；代表性论文-3, 4, 5和7

4. 国际上第一个报道了确证功能的WSSV基因，wsv214，它的编码产物为强碱性多肽，具有DNA结合的功能，估计类似于真核生物组蛋白，起压缩和包装基因组DNA的作用。 所属学科分类：水产保护学；代表性论文-9

5. 首次发现WSSV基因组上有一易变区，不同来源的病毒株在该区域发生了大片段DNA缺失现象，最大达8kb以上，包含了5个编码基因，经感染实验发现，片段缺失仅导致病毒的毒力减弱，并不影响其感染活性，提示病毒的缺失基因可能与病毒的毒力相关。所属学科分类：水产保护学；代表性论文-10

主要完成人：  1.   杨丰

建立了WSSV的基因组DNA纯化技术，病毒基因组DNA文库和cDNA文库构建，病毒全基因组DNA序列生物信息学分析，病毒基因的鉴定和功能研究。

2.   章晓波

进行WSSV的蛋白质组学及病毒膜蛋白的研究，并指导研究生进行WSSV基因功能、RNAi等研究，撰写研究论文。

3.   徐洵

1995-2002 负责本课题的启动，设计，研究生指导和论文撰写。2001年以后开始启动对虾抗病毒分子基础的研究。

10篇代表性论文：  1.   A simple and efficient method for purification of prawn baculovirus DNA. J. Virol. Methods, 67, 1-4

2.   Complete genome sequence of the shrimp White Spot Bacilliform Virus. J. Virol., 75 (23), 11811-20

3.   Proteomic analysis of shrimp white spot syndrome viral proteins and characterization of a novel envelope protein VP466. Mol Cell Proteomics. 1(3):223-31

4.   Transcription and identification of an envelope protein gene (p22) from shrimp white spot syndrome virus. J Gen Virol., 83: 471-7

5.   Identification of white spot syndrome virus (WSSV) envelope proteins involved in shrimp infection. Virology. 332(2):578-83.

6.   Identification of a collagen-like protein gene from white spot syndrome virus. Arch Virol., 149:215-23

7.   Interaction of white spot syndrome virus VP26 protein with actin. Virology. 336(1):93-9

8.   A simple and efficient method for purification of intact White Spot Syndrome Virus (WSSV) viral particles. Virus Res. 108, 63-7

9.   The structure and function of a gene encoding a basic peptide from prawn white spot syndrome virus. Virus Res. 79:137-44

10.  Genomic instability of prawn white spot bacilliform virus (WSBV) and its association to virus virulence. Virus Res. 2002, 90: 269-74