项目名称：    医学分子诊断新技术的研究

推荐单位：    宁波市

项目简介：    1. 科学技术领域：本项目属基础医学类医学分子生物学领域。

2. 主要内容：（1）在国际上首次联用免疫磁珠阳性和阴性筛选及定量逆转录聚合酶链反应（PCR）技术，建立了外周血中微量消化系统恶性肿瘤细胞检测及判断其临床意义的医学分子诊断新技术。（2）以癌胚抗原（CEA）mRNA作为分子标志，采用免疫磁珠/RT-PCR技术检测胃癌患者外周血中的癌细胞，分析了其阳性检出率与病期的相关性，发现早期患者也有25%的阳性率；在结直肠癌的研究中发现CEA mRNA的检出率与Dukes 分期呈正相关。（3）结肠癌患者外周血细胞角蛋白20（CK20） mRNA 的检出率与肿瘤大小、淋巴结及肝转移相关。（4）通过对肝癌、肝硬化和肝炎患者外周血中甲胎蛋白（AFP）mRNA的系统比较研究，发现这一分子标志在肝癌鉴别诊断和血道转移监测方面比AFP蛋白更有优越性。（5）应用PCR、PCR-AFLP、PCR-RFLP、SSCP、DHPLC、DNA测序等研究技术，对男性不育、表皮松解性掌跖角化症、注意缺陷多动障碍等常染色体显性遗传病和多基因疾病进行了疾病易感基因的寻找、基因突变谱的绘制、遗传咨询等研究工作；（6）新技术应用于肿瘤微转移、遗传病的诊断中，产生了较大的社会效益。

3. 科学价值：先用阴性免疫磁珠去除绝大部分的白细胞，然后用阳性免疫磁珠富集肿瘤细胞，最后用特异性高的定量RT-PCR分析肿瘤细胞特异的mRNA，建立了可靠而稳定的分析外周血微量消化系统恶性肿瘤细胞的方法。结合了免疫磁珠与RT-PCR两者的优点，使检测的特异度和灵敏度均大大提高。优于文献报道的方法；同时克服了单独使用RT-PCR具有一定假阳性和假阴性的缺点。遗传性疾病的研究中，不少方面的成果是国际首报，对探讨几种遗传病的分子机制、分子诊断和产前诊断等，都具有一定的重要理论意义和应用价值。

4. 同行引用评价：被他人正面引用31次，其中SCI文章14篇。在4家医疗机制推广应用。

主要发现点：  1.联用阴性和阳性免疫磁珠及实时定量RT-PCR检测外周血恶性肿瘤细胞方法的建立：先用CD45免疫磁珠去除绝大部分的白细胞，然后用上皮细胞特异的Ber-EP4免疫磁珠富集肿瘤细胞，最后用特异性高的实时定量RT-PCR检测肿瘤细胞中的标志mRNA，以确定血道中癌细胞的组织来源。本方法的特异度和灵敏度均高于国内外文献报道的。（医学分子生物学；论文[1]、[2]）

2.以癌胚抗原（CEA）mRNA作为分子标志，发现胃癌、结直肠癌血道转移是一个较普遍的早期事件。以细胞角蛋白20（CK20）mRNA作为分子标志，发现结直肠癌外周血癌细胞检出率与肿瘤原发灶大小、淋巴结及肝转移相关。通过对肝癌、肝硬化和肝炎患者外周血中甲胎蛋白（AFP）mRNA的系统比较研究，发现AFP mRNA检测在肝癌鉴别诊断和血道转移监测方面比AFP蛋白检测更具有优越性。（医学分子生物学；论文[1]、[3]、[4]、[5]）

3.分析了我国表皮松解性掌跖角化症家系的KRT 9基因突变，探讨了基因突变与临床表现的关系，在国际上首先发现1种新的突变，被国际中间纤维突变数据库收录。通过对注意缺陷多动障碍（ADHD）患者儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)基因的分析，发现汉族儿童注意缺陷多动障碍患者的COMT基因 Val 158 Met多态性与ADHD无关联，首次提出不能以COMT基因作为一个关联因素应用于ADHD的临床分子诊断。（分子遗传学；论文[6]、[7]、[8]）

4.采用多重PCR的方法，对分布于AZF区与精子产生有关的3个区域内的4个STS位点：sY86（位于AZFa亚区）、sY127（位于AZFb亚区）、sY254 和sY255（位于AZFc亚区）进行缺失检测，同时用RT-PCR技术检测无精症、少精症患者中最易缺失的AZFc区DAZ基因在不同组织中的表达情况，并采用PCR-SSCP方法对DAZ基因内横跨1个外显子和1个内含子的sY254位点的点突变进行分析。首次证实部分汉族无精症患者可能与AZFc的缺失有关。对精神分裂症的分子诊断标记研究中，针对国内外十分关注的精神分裂症可能的易感基因5-HTR2A，探讨了其102T/C SNP在2个汉族群体精神分裂症群体中的分布，初步否定了关联性。针对1个少见的常染色体显性遗传Stargardt黄斑营养不良-3样家系，筛查了目前已知与STGD相关的3个候选基因ELOVL4、RDS和ABCR的突变信息，提示STGD3可能存在别的未知基因突变。论文发表于《Journal of Cellular and Molecular Medicine》，并被国际著名的"GeneCards"数据库（http://www.genecards.org/）列位该病研究的Top 10文献。（分子遗传学；论文[9]、[10]）

主要完成人：  1.   郭俊明

在本项目的第1、2发现点上做出了创造性贡献，建立了血液中微量消化系肿瘤细胞的检测方法。论文1-5、12的通讯作者，论文7、11、14的共同作者。本人在该项研究中的工作量占本人工作量的60%。

2.   张咸宁

在本项目的第3、4发现点上做出了创造性贡献，建立了分子遗传学新检测技术及其应用。论文6-8、10、13-17的通讯作者，论文9的共同作者。本人在该项研究中的工作量占本人工作量的60%。

3.   肖丙秀

在本项目的第1、2发现点上做出了创造性贡献，参与建立检测肿瘤微转移的新技术。论文1-5、11、12的共同作者。本人在该项研究中的工作量占本人工作量的55%。

4.   张新军

在本项目的第2发现点上做出了创造性贡献，参与恶性肿瘤微转移检测新技术的研究和临床应用。论文1、4的共同作者，论文11的通讯作者。本人在该项研究中的工作量占本人工作量的35%。

5.   乐燕萍

在本项目的第3、4发现点上做出了创造性贡献，参与分子遗传新技术的研究和应用。论文6、8的共同作者。本人在该项研究中的工作量占本人工作量的35%。

10篇代表性论文：  1.   Combined use of positive and negative immunomagnetic isolation followed by real-time RT-PCR for detection of the circulating tumor cells in patients with colorectal cancers/ Journal of Molecular Medic

2.   3种富集胃癌患者外周血中胃癌细胞方法的比较/世界华人消化杂志

3.   免疫磁珠与荧光定量逆转录聚合酶链反应在胃癌患者外周血癌细胞检测中的应用价值/中华检验医学杂志

4.   Detection of cytokeratin 20 mRNA in the peripheral blood of patients with colorectal cancer by immunomagnetic beads enrichment and real time reverse transcriptase-polymeras chain reaction/ Journal of

5.   Detecting AFP mRNA in peripheral blood of the patients with hepatocellular carcinoma, liver cirrhosis and hepatitis/Clinica Chimica Acta

6.   A novel mutation of keratin 9 gene (R162P) in a Japanese family with epidermolytic palmoplantar keratoderma/ British Journal of Dermatology

7.   An insertion-deletion mutation in keratin 9 in three Chinese families with epidermolytic palmoplantar keratoderma/ British Journal of Dermatology

8.   注意缺陷多动障碍与儿茶酚-O-甲基转移酶基因Vall58Met多态性的关联分析/中华医学遗传学杂志

9.   无精症、少精症患者中AZF缺失的检测/生殖与避孕

10.  102T/C SNP in the 5-hydroxytryptamine receptor 2A (HTR2A) gene and schizophrenia in two southern Han Chinese populations: Lack of association/ American Journal of Medical Genetics Part B-Neuropsychiat