项目名称：    乙肝表面抗原-抗体复合物消除免疫耐受的应用基础研究

推荐单位：    教育部

项目简介：    本项目属基础医学领域。

幼龄感染乙肝病毒所致的免疫耐受是学者面临的重要难题，诱生有效针对乙肝病毒的机体免疫应答是消除耐受的关键，但因缺乏系统的应用基础性研究，尚未取得突破性进展。在鸭乙肝动物模型中首次发现病毒抗原-抗体复合物可消除免疫耐受的基础上，本项目对乙肝病毒表面抗原（HBsAg）-抗体 (anti-HBs)复合物（IC）经抗原呈递细胞（APC）作用后的机制与效应提出设想，系统研究消除免疫耐受的机理，并在临床研究中予以验证。

（1）用体外共孵育方法，发现IC提高了APC摄取及呈递HBsAg的功能，特异地激活T细胞，促进产生Th1类细胞因子。在HBsAg阳性转基因鼠中用复合物免疫，可增强特异性杀伤性T细胞的作用，增加Th1类细胞因子的分泌，诱生抗-HBs。发现复合物中抗HBs 的Fc段是介导上述作用的关键；用蛋白酶去除抗HBs Fc段，或换用异种动物抗体，则作用显著降低。

（2）鉴于IC是通过外源性抗原呈递途径诱导特异性免疫应答，在此基础上，创新性地设计经外源、内源性两种途径呈递HBsAg的方法，将带有编码乙肝表面抗原基因的质粒DNA加入复合物组成IC-HBS质粒DNA三重复合物，在HBsAg阳性转基因鼠中可降低肝细胞内HBsAg。获我国、欧、美授权发明专利。发现质粒DNA 中CpG有利于局部诱生Th1细胞因子；机械注射在小鼠皮肤内可通过Toll-样受体-9介导释放细胞因子。

（3）借助APC表面标记检测及T细胞激活试验，在乙肝患者中证实APC与T细胞间相互作用低下。用复合物免疫正常人，可诱生高效价抗体及Th1细胞因子；用复合物免疫患者，患者的Th1类细胞因子表达升高，且血清中出现HBeAg抗体及病毒滴度下降，验证了动物实验所揭示的机制。本研究为有效治疗乙肝患者奠定了理论基础。

10篇主要论文被Lancet Infectious Diseases, Nature Review Microbiology，Nature Biotechnology , Hepatology 等引用101次。

主要发现点：  1．发现乙肝病毒表面抗原（HBsAg）与高亲和力抗体（抗-HBs）组建的抗原-抗体免疫原性复合物 （Immuogenic complex,IC）与传统认为引起III型变态反应的抗原-抗体免疫复合物有本质不同的作用。IC通过其中抗体Fc段的介导，经抗原呈递细胞表面的Fc受体，将IC中的HBsAg被动地带入抗原呈递细胞内，使原来因免疫耐受而不能识别HBsAg的抗原呈递细胞增强摄取HBsAg。经过加工的HBsAg呈递给T细胞，激活的T细胞可诱生T杀伤性细胞，产生细胞因子及体液免疫应答。而引起III型变态反应的抗原-抗体复合物或因抗原-抗体比例不当，或因抗体亲和力低下，在血循环中长期、大量存在,沉积在小血管内壁，引起疾病。（属医学微生物学科及免疫学科。代表性论文 1，2，4及中国发明专利 ZL93112409）.

2．发现在HBsAg-抗-HBs复合物中加入重组编码S基因质粒DNA 组建-三重复合物，可更有效地消除对乙肝病毒抗原的免疫耐受。HBsAg-抗-HBs复合物是通过细胞摄入而加工、呈递，属外源性抗原呈递过程；质粒S-DNA则通过细胞内表达HBsAg抗原，经内源性抗原加工呈递过程。推测如HBsAg经外源性及内源性两种不同途径进行抗原呈递，可更有效地诱生特异性免疫应答。在HBsAg阳性转基因鼠中，用三重复合物免疫，更有效地激活T杀伤细胞，激发Th1类细胞因子，显著降低肝内HBsAg。此外，还发现质粒DNA中的CpG核苷酸序列可在局部形成有利于TLR9阳性细胞归巢，促进淋巴结细胞表达IL-12 mRNA，提供Th1型免疫反应的微环境。（属医学微生物学科，及免疫学科。代表性论文 4，7，8，9，10。获中、美、欧洲发明专利授权，专利号分别为ZL971062919,6221664B1, 0913157）

3．发现在慢性乙肝患者中HBsAg-抗-HBs复合物有消除免疫耐受的作用。慢性乙肝患者中，抗原呈递细胞-T细胞间相互作用功能低下。慢性乙肝患者树突状细胞经与复合物孵育后，CD80,CD86,CD40,HLA-II 标记表达上调，IL-12分泌水平也提高。慢性乙肝患者注射HBsAg-抗-HBs复合物后，Th1 类细胞因子升高，HBeAg转阴，出现e抗体，血清病毒DNA降低。此外，正常人用复合物免疫后可产生高效价抗-HBs 及Th1类细胞因子。（属医学微生物学科、及传染病学科。代表性论文3，5，6）

主要完成人：  1.   闻玉梅

提出免疫耐受及消除免疫耐受的设想。对本项目提出整体思路及设计，提出阶段性研究课题。设计鸭乙肝，鼠、转基因鼠以及乙肝患者的全部实验。参加鸭乙肝动物实验及部分小鼠实验。参加IC的具体配比及三重复合物的实验研究及部分动物实验，指导研究生及研究人员进行实验，对实验结果分析与总结，撰写论文(论文1-5,论文9-10)，对第一、二及三点均有创造性贡献，在该项研究中的工作量占本人工作量的60%。

2.   袁正宏

1．组建了拥有自主知识产权的带有编码HBsAg的基因重组质粒DNA（发明专利号：ZL01105250）；

2．发现了皮肤中TLR9的表达可受应急和外伤等诱导，识别CpG后可快速产生细胞因子，部分揭示了皮肤先天免疫的机制，以此为基础建立了物理损伤和CpG DNA作为佐剂的增强疫苗接种免疫效果的新策略。

3．参与实施了乙克治疗性疫苗的部分临床实验，为开展临床实验的研究打下了

良好基础。

论文为6-10，对第二及三点有创造性贡献，在该项研究中的工作量占本人工作量的60%。

3.   瞿涤

负责该项目鸭乙肝病毒分离及抗原抗体血清学研究方法的建立，参加小鼠抗原-抗体-DNA的实验及设计，乙肝患者DC细胞免疫功能的研究，论文为2,4,5,10，对第二及三点有创造性贡献，在该项研究中的工作量占本人工作量的55%。

4.   姚忻

参加治疗性乙肝疫苗抗原抗体配比实验，参加转基因鼠的实验以及其他的动物实验。乙克临床研究病人血淋巴细胞及树突状细胞的功能研究实验。具体进行流式细胞CBA实验检测病人各阶段血清和外周血淋巴细胞特异性TH1/TH2细胞因子表达情况。论文为4，对第二及三点有创造性贡献，在该项研究中的工作量占本人工作量的70%。

5.   何丽芳

参加该项目全过程。具体指导并参与有关组建抗原-抗体复合物的实验研究及部分动物实验。

参加转基因鼠的实验工作，参加整理与分析实验结果。

论文为4与10，对第一及二点有创造性贡献，在该项研究中的工作量占本人工作量的50%。

10篇代表性论文：  1.   Enhanced immunogenicity in mice with Hepatitis B vaccine complexed to human hepatitis B immunoglobulin. Chinese Medical Journal.1994:107 (10): 741-744

2.   Antigen-antibody complex as therapeutic vaccine for viral hepatitis B. Inter Rev Immunol 1999; 15:251-258.

3.   Hepatitis B vaccine and anti-HBs complex as approach for vaccine therapy. The Lancet 1995; 345: 1575-1576

4.   Therapeutic efficacy of hepatitis B surface antigen-antibodies-recombinant DNA composite HBsAg transgenic mice. Vaccine 2001: 19:4219-4225.

5.   Selective functional deficit in dendritic cell-T cell interaction is a crucial mechanism in chronic hepatitis B virus infection. J Viral Hepatitis 2004; 11:217-224.

6.   Toll-like receptor-9 induced by physical trauma mediates release of cytokines following exposure to CpG motif in mouse skin. Immunology. 2003:110:341-347

7.   Th2 immunity to HBsAg primed by gene gun DNA vaccination can be shifted towards Th1 immunity by co-delivery of CpG motifs-containing ODN. Scandinavian Journal of Immunology. 2003, 58:350-357.

8.   CpG motif acts as a danger signal and provides a T helper type 1-biased microenvironment for DNA vaccination. Immunology. 2005 Jun;115(2):223-30.

9.   Vaccination with recombinant HBsAg-HBIG complex in healthy adults. Vaccine 2005; 23:2658-2664

10.  Effect of Plasmid DNA on Immunogenicity of HBsAg-Anti-HBs Complex.. Viral Immunology 1998 ; 11；65-72